應(ying)用黴菌培養(yang)箱進行(xing)真菌體(ti)內致病(bing)性研(yan)究(jiu)：方(fang)法(fa)與(yu)金標準(zhun)驗(yan)證(zheng)

摘(zhai)要(yao)：在(zai)醫學(xue)真(zhen)菌學(xue)研(yan)究(jiu)領(ling)域(yu)，明(ming)確(que)病(bing)原真(zhen)菌的致(zhi)病(bing)性是(shi)理(li)解(jie)其(qi)發病(bing)機(ji)制(zhi)、評(ping)估治療策(ce)略(lve)及(ji)開(kai)發新藥(yao)的核(he)心(xin)。利(li)用(yong)動(dong)物模型(xing)進(jin)行(xing)體(ti)內感染實驗，被視為(wei)驗證(zheng)真菌致病(bing)性的(de)“金標準(zhun)”。本(ben)方案旨(zhi)在(zai)闡述(shu)如何(he)系統(tong)性地建(jian)立(li)並評估真菌動物感染模型(xing)，其(qi)中(zhong)黴菌培養(yang)箱在(zai)關鍵(jian)步(bu)驟(zhou)中扮演著(zhe)的(de)角(jiao)色，用於(yu)量(liang)化(hua)真菌負荷(he)與評(ping)估感染進程。

壹、 研(yan)究(jiu)目標(biao)與核(he)心(xin)思(si)路

本(ben)研(yan)究(jiu)旨(zhi)在(zai)通過標(biao)準(zhun)的(de)動物感染模型(xing)，評(ping)估目標(biao)真菌菌株（如(ru)臨床分離(li)株(zhu)、基因敲(qiao)除/過(guo)表達株）的體(ti)內致病(bing)能(neng)力(li)強弱。核(he)心(xin)思(si)路是：將(jiang)真菌以特定(ding)方式接(jie)種於(yu)易(yi)感動(dong)物，隨後通過壹系列終(zhong)點(dian)指標(biao)（生(sheng)存率(lv)、組織載(zai)菌量、病(bing)理(li)損傷(shang)），客(ke)觀(guan)、定(ding)量地比較(jiao)不(bu)同菌株的(de)毒力差(cha)異(yi)。整個過(guo)程高(gao)度依賴於黴菌培養(yang)箱對回(hui)收(shou)真菌的準(zhun)確(que)培養與計(ji)數。

二、 動(dong)物感染模型(xing)的(de)建(jian)立(li)

實驗動物選擇(ze)：

常用模(mo)型(xing)：小(xiao)鼠(shu)是(shi)泛使用的(de)模(mo)型(xing)動(dong)物。根據(ju)研究目的(de)，可選擇(ze)免疫(yi)正常的野(ye)生(sheng)型(xing)小(xiao)鼠(shu)，或(huo)免疫缺(que)陷(xian)小鼠(shu)（如(ru)中性粒細(xi)胞減(jian)少癥模型(xing)、Cyclophosphamide處(chu)理(li)小鼠(shu)），後者對條(tiao)件(jian)致(zhi)病(bing)真菌（如曲(qu)黴、念珠(zhu)菌）更為(wei)敏感，能(neng)模(mo)擬免疫功(gong)能(neng)低下宿主(zhu)的(de)嚴重感(gan)染。

感(gan)染方式與(yu)途(tu)徑(jing)：

全(quan)身(shen)播(bo)散(san)性(xing)感(gan)染模型(xing)：通過尾靜(jing)脈(mai)註(zhu)射(she)壹定(ding)濃度(du)的(de)真菌孢子或酵母(mu)細(xi)胞懸液(ye)。此模(mo)型(xing)用(yong)於(yu)研(yan)究(jiu)真菌的全(quan)身性定(ding)植、擴散(san)能(neng)力(li)及(ji)對抗(kang)真(zhen)菌藥物的全(quan)身療(liao)效(xiao)。

侵(qin)襲(xi)性(xing)肺(fei)曲(qu)黴病(bing)模型(xing)：通過鼻(bi)腔吸入(ru)或氣管(guan)內接種孢(bao)子懸液。這(zhe)是研究(jiu)見侵(qin)襲(xi)性(xing)真(zhen)菌病(bing)——侵(qin)襲(xi)性(xing)肺(fei)曲(qu)黴病(bing)的經(jing)典(dian)模型(xing)。

皮(pi)膚(fu)或(huo)皮下感染模型(xing)：在(zai)剃毛(mao)皮(pi)膚表面塗(tu)抹(mo)或進行皮(pi)下註射(she)，用(yong)於(yu)研究(jiu)皮膚(fu)癬(xuan)菌或皮(pi)下真菌病(bing)的致(zhi)病(bing)過程(cheng)。

三(san)、 致(zhi)病(bing)性評(ping)估的核(he)心(xin)指標(biao)與(yu)方法(fa)

感(gan)染模型(xing)建(jian)立(li)後，需通過以下多(duo)維度(du)的指標(biao)進(jin)行系(xi)統評估：

生(sheng)存率(lv)分析(xi)：最(zui)直(zhi)接(jie)、力的終(zhong)點(dian)指標(biao)。

方(fang)法(fa)：設(she)立(li)對照(zhao)組（如(ru)PBS註射(she)）與(yu)實驗組（接(jie)種不(bu)同菌株），每(mei)日觀(guan)察並(bing)記(ji)錄(lu)動物的生(sheng)存狀(zhuang)態(tai)。

數(shu)據(ju)分析(xi)：繪(hui)制(zhi)Kaplan-Meier生(sheng)存曲(qu)線，使(shi)用Log-rank檢驗比較(jiao)不(bu)同組間(jian)的生(sheng)存率(lv)差(cha)異(yi)。生(sheng)存期(qi)顯著(zhu)縮短的(de)組別，其感(gan)染菌株的(de)毒力更強。

組織器(qi)官真(zhen)菌載(zai)量(liang)定(ding)量分析(xi)：關鍵(jian)量(liang)化(hua)指標(biao)，依賴黴菌培養(yang)箱完成(cheng)。

方(fang)法(fa)：在(zai)感染後設(she)定(ding)的時間點(dian)（如24h, 48h, 72h, 7天）處死(si)動(dong)物，無菌采(cai)集(ji)目標(biao)器(qi)官（肺(fei)、肝、脾(pi)、腎、腦(nao)等(deng)）。

勻漿(jiang)與(yu)培養(yang)：將(jiang)組織稱重後加入(ru)無菌PBS進行(xing)勻漿(jiang)。取(qu)適(shi)量(liang)勻漿(jiang)液(ye)進行(xing)系列稀釋(shi)，塗(tu)布於選擇(ze)性固體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)（如含氯(lv)黴素(su)的(de)SDA平(ping)板(ban)）上(shang)。

黴菌培養(yang)箱的作(zuo)用：將(jiang)塗(tu)布後的平(ping)板(ban)置(zhi)於(yu)黴菌培養(yang)箱中，在(zai)適宜(yi)真(zhen)菌生(sheng)長(chang)的溫(wen)度（通常25-30℃或37℃，視菌種而(er)定(ding)）下培養(yang)24-72小(xiao)時。

結(jie)果判定(ding)：計(ji)數(shu)平(ping)板(ban)上(shang)的(de)菌落形成單位(wei)，並根據(ju)稀釋(shi)倍(bei)數(shu)和器(qi)官重量(liang)，計(ji)算每(mei)克組織中的CFU數(shu)量(liang)。載(zai)菌量越高(gao)，表明(ming)真(zhen)菌在(zai)該(gai)組織中的增殖和定(ding)植能(neng)力(li)越強。

組織病(bing)理(li)學(xue)分析(xi)：直(zhi)觀(guan)顯示(shi)真(zhen)菌-宿主(zhu)相(xiang)互(hu)作用(yong)的形態(tai)學(xue)指標(biao)。

方(fang)法(fa)：取(qu)部(bu)分組織用福爾馬林(lin)固定(ding)，石蠟包(bao)埋(mai)後切片。

特(te)殊染色：采(cai)用(yong)過(guo)碘(dian)酸希夫染色（PAS）或六胺銀(yin)染色（GMS），這些(xie)染色能(neng)特(te)異(yi)性地將(jiang)真菌細胞壁染成紅色或黑(hei)褐色，使其(qi)在(zai)組織背景(jing)下清晰(xi)可見。

鏡(jing)下觀(guan)察：在(zai)光學(xue)顯(xian)微鏡下評估：

真(zhen)菌侵(qin)襲(xi)程(cheng)度(du)：菌絲/孢(bao)子在(zai)組織中的分布(bu)範(fan)圍、深(shen)度。

菌絲形態(tai)：觀(guan)察體(ti)內菌絲形態(tai)是(shi)否(fou)與(yu)體(ti)外培(pei)養(yang)壹致。

宿(xiu)主(zhu)反應(ying)：炎(yan)癥細胞浸(jin)潤(run)類(lei)型(xing)（中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞、巨噬(shi)細(xi)胞等(deng)）、組織壞死(si)、肉(rou)芽(ya)腫(zhong)形成等(deng)病(bing)理(li)變(bian)化(hua)。

四(si)、 黴菌培養(yang)箱在(zai)本研(yan)究(jiu)中(zhong)的核(he)心(xin)價(jia)值(zhi)

在(zai)整個研(yan)究鏈(lian)條(tiao)中，黴菌培養(yang)箱並非(fei)僅是(shi)壹個培養(yang)工(gong)具，而(er)是實現(xian)定(ding)量化(hua)、標準(zhun)化(hua)評估的基石(shi)：

精(jing)準(zhun)定(ding)量：通過提(ti)供穩(wen)定(ding)、均壹的培養(yang)環(huan)境(jing)，確(que)保從組織中回收(shou)的真(zhen)菌能(neng)夠(gou)可靠(kao)地形成可(ke)見菌落，使得CFU計數準(zhun)確(que)可靠(kao)，這(zhe)是比較(jiao)不(bu)同菌株或(huo)不(bu)同處理(li)組間(jian)毒力差(cha)異(yi)的客(ke)觀(guan)數據(ju)基(ji)礎(chu)。

標(biao)準(zhun)化(hua)操作：所(suo)有(you)組織樣本在(zai)相(xiang)同(tong)的(de)培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)下處理(li)，避免了因培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)波(bo)動引入(ru)的誤(wu)差(cha)，保(bao)證(zheng)了實驗結果的(de)重復(fu)性(xing)與可(ke)比性。

結(jie)論(lun)：綜(zong)合(he)利(li)用(yong)動物模型(xing)與(yu)黴菌培養(yang)箱等(deng)關鍵(jian)技(ji)術(shu)，建(jian)立(li)系統的體(ti)內致病(bing)性研(yan)究(jiu)方(fang)案，是(shi)解(jie)析(xi)真菌毒力(li)因子、評估新型(xing)抗(kang)真(zhen)菌藥物或宿(xiu)主導(dao)向療法(fa)效(xiao)能(neng)的(de)黃金法則。其中(zhong)，黴菌培養(yang)箱在(zai)將(jiang)“感染”這壹生(sheng)物學(xue)過(guo)程(cheng)轉化(hua)為(wei)可精確(que)測(ce)量的(de)“數(shu)據(ju)”（CFU/g組織）方面，發揮著(zhe)不(bu)可替代的核(he)心(xin)作(zuo)用(yong)，為(wei)真菌致病(bing)機(ji)理(li)研究(jiu)與(yu)防(fang)控策(ce)略(lve)開(kai)發提供了堅實的技術支(zhi)撐(cheng)。