慢病毒(du)包(bao)裝(zhuang)詳細過(guo)程

壹(yi)、實驗(yan)準備

1、健(jian)康(kang)的(de)HEK 293T細胞，壹般(ban)使用復蘇(su)後(hou)10代(dai)以(yi)內的(de)細胞進行(xing)慢病毒(du)的(de)生產(chan)，要求(qiu)無細菌(jun)、真菌(jun)以(yi)及支(zhi)原體汙(wu)染；

2、轉(zhuan)染試劑(ji)，如(ru)PEI、Higene、lipo2000或lipo3000

各(ge)種轉(zhuan)染試劑(ji)的(de)步驟稍有差(cha)別(bie)，小(xiao)助(zhu)手以(yi)PEI為轉(zhuan)染試劑(ji)。

3、DMEM無(wu)血(xue)清(qing)無雙(shuang)抗(kang)培養(yang)基(ji)、DMEM培養(yang)基(ji)（10%FBS和(he)1%P/S）；

4、10mL無(wu)菌(jun)註射(she)器(qi)(環(huan)氧(yang)乙(yi)烷(wan)滅菌(jun)處理)；

5、0.45μm的(de)細菌(jun)濾(lv)器(qi)。

二(er)、包(bao)裝(zhuang)步(bu)驟

Day1

（7:00 PM）鋪(pu)板HEK 293T細胞

數(shu)量：400萬(wan)/10 cm dish ；覺(jiao)得(de)計數(shu)麻煩(fan)的(de)話，可以(yi)在293T細胞長到(dao)約(yue)90%匯(hui)合時，1:5傳(chuan)代(dai)（均(jun)分(fen)成(cheng)5份(fen)），每(mei)1份(fen)的(de)數目(mu)差(cha)不(bu)多(duo)就是(shi)400萬(wan)了(le)。

Day2

（3:00 PM）三(san)質粒(li)轉(zhuan)染

在培養(yang)箱中(zhong)恢復細胞狀(zhuang)態約(yue)20h，此(ci)時可進行(xing)轉(zhuan)染。三(san)質粒(li)的(de)轉(zhuan)染體系三(san)種質粒(li)的(de)配(pei)比有(you)許多(duo)種方式(shi)，目(mu)前MDL使用4:3:1的(de)比例(li)，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(載(zai)有妳(ni)基(ji)因(yin)的(de)質粒(li))。10cm dish壹(yi)般(ban)轉(zhuan)染質粒(li)的(de)總質(zhi)量為20μg，PEI的(de)量為質(zhi)粒(li)的(de)2.5-3倍(bei)（也(ye)就是(shi)50μg-60μg，壹(yi)般(ban)推(tui)薦按(an)照(zhao)2.5倍(bei)來）。按(an)照(zhao)比例(li)算下(xia)來(lai)，PxpAx2：PMD2g：PLVX的(de)質量比為：(10ug:7.5ug:2.5ug)

註意：在提(ti)到(dao)質(zhi)粒(li)的(de)量時，千萬(wan)記得(de)說(shuo)質(zhi)量(liang)而不(bu)是(shi)濃度，不(bu)然容易(yi)出錯。

實(shi)驗(yan)步驟(zhou)：

取(qu)如(ru)上總質(zhi)量為20μg的(de)質粒(li)添(tian)加到(dao)總體(ti)積500μL的(de)DMEM無(wu)血(xue)清(qing)無雙(shuang)抗(kang)培養(yang)基(ji)中(zhong)，記為A液，移液槍混勻20次(ci)；

取(qu)PEI(壹(yi)般(ban)配(pei)置成(cheng)1μg/mL)50-60μg（也(ye)就是(shi)50-60μL）添(tian)加到(dao)總體(ti)積500μL的(de)DMEM無(wu)血(xue)清(qing)無雙(shuang)抗(kang)培養(yang)基(ji)中(zhong)，記為B液，移液槍混勻20次(ci)；

將(jiang)B液逐滴滴加到(dao)A液中，移液槍輕柔混(hun)勻66次(ci)，室溫靜(jing)置15-20min；

將(jiang)靜置好的(de)轉(zhuan)染試劑(ji)（A+B）緩(huan)緩(huan)滴加到(dao)恢(hui)復狀(zhuang)態20h的(de)HEK 293T細胞中。

做(zuo)好(hao)標記，記好(hao)轉(zhuan)染時間、轉(zhuan)染質粒(li)、換(huan)液時間等(deng)參(can)數(shu)提(ti)高(gao)實驗(yan)重復性。

Day3

（9:00 AM）換(huan)液

轉(zhuan)染後的(de)第18h，將(jiang)含有轉(zhuan)染試劑(ji)的(de)HEK 293T上清(qing)更換(huan)為10mL DMEM培養(yang)基(ji)；對(dui)於新手(shou)，為了(le)防止(zhi)在換(huan)液時將細胞吹散，可以(yi)留(liu)3mL的(de)液體在dish中(zhong)，更換(huan)8mL DMEM培養(yang)基(ji)。

Day4

（3:00 PM）收(shou)集病毒(du)液

在轉(zhuan)染後的(de)48-72h，為病(bing)毒(du)生產(chan)的(de)高(gao)峰(feng)期(qi)，壹般(ban)我(wo)們(men)收集轉(zhuan)染後48h（換(huan)液後30h，產(chan)毒(du)30h）的(de)病毒(du)液用於實驗(yan)，足以(yi)滿足(zu)大部分(fen)實(shi)驗(yan)需(xu)求(qiu)。收集病毒(du)於15mL tube中(zhong)，500g，5mL離(li)心去(qu)細胞碎片和(he)雜質，隨後(hou)使用註射(she)器(qi)和(he)濾(lv)器(qi)進行(xing)過(guo)濾(lv)。收(shou)集後的(de)病毒(du)上清(qing)可以(yi)用來(lai)進行(xing)感染和儲(chu)存。

三(san)、慢病毒(du)滴度測定

病(bing)毒(du)滴度的(de)單(dan)位(wei)為：TU/mL，代(dai)表每(mei)毫升(sheng)病毒(du)液中具有轉(zhuan)導(dao)功(gong)能(neng)的(de)病毒(du)顆粒(li)的(de)數目(mu)。

計(ji)算公式(shi)為：滴度=（感(gan)染時細胞數（個(ge)）*陽(yang)性細胞%）/病(bing)毒(du)液體積（mL）

病(bing)毒(du)液體積和感(gan)染時細胞數已(yi)知(zhi)，需(xu)通過(guo)流(liu)式(shi)細胞術確(que)認陽(yang)性細胞百分(fen)比。

滴度測定常(chang)常(chang)使用HEK 293T細胞，大致(zhi)的(de)原理為，將(jiang)在DAY3收(shou)集到(dao)的(de)病毒(du)上清(qing)，按(an)照(zhao)梯(ti)度添(tian)加到(dao)293T細胞中，感染後48h檢(jian)測陽(yang)性細胞的(de)比例(li)，從(cong)而確(que)定病(bing)毒(du)的(de)滴度。

四、註意事項

293T細胞的(de)代(dai)數(shu)最好用15代(dai)以(yi)內，最多(duo)不(bu)超(chao)過(guo)20代(dai)，否(fou)則影(ying)響(xiang)轉(zhuan)染效率。質粒(li)濃度在400-1000ng/μL範(fan)圍(wei)，純度260/280在1.8-2.0之(zhi)間的(de)轉(zhuan)染效率較高(gao)。混合體輕輕滴入細胞上清(qing)後搖勻，動(dong)作要輕，293T細胞貼壁(bi)不(bu)牢避(bi)免(mian)細胞脫落。