幹細胞(bao)的培養(yang)

　　培養前(qian)的工(gong)作(zuo)準(zhun)備充(chong)分(fen)
 

　　包括(kuo)耗材(cai)的處理(li)、試(shi)劑的配(pei)置，無(wu)菌檢(jian)驗(yan)等(deng)等。
 

　　玻(bo)璃器(qi)皿(min)的清(qing)洗(xi)。對於玻璃器(qi)皿(min)(細胞(bao)瓶、裝(zhuang)營(ying)養液(ye)的瓶子(zi)、小青(qing)黴(mei)素瓶等(deng))要(yao)先(xian)用(yong)洗衣(yi)粉(fen)刷(shua)幹凈(jing)(註(zhu)意(yi)死角)，然後(hou)沖(chong)幹凈(jing)。用(yong)酸(suan)液浸(jin)泡 24 h 以上，之(zhi)後用(yong)清(qing)水(shui)沖(chong)洗 10 遍(bian)，除去(qu)殘(can)留酸(suan)液。瓶子(zi)之(zhi)類，沖(chong)洗過(guo)程(cheng)要(yao)使勁(jin)搖(yao)晃。然後(hou)在(zai)雙蒸水(shui)浸(jin)泡 24 h。晾(liang)幹後(hou)包紮(zha)，使用(yong)鼓風(feng)幹燥(zao)箱(xiang)160℃ 幹烤(kao) 2 h 待用(yong)。
 

　　試(shi)劑配(pei)置。細胞(bao)培(pei)養用(yong)的液體(ti)壹(yi)般(ban)使用(yong)雙蒸以上的水(shui)即(ji)可。並註(zhu)意(yi) pH 值的調節。
 

　　無(wu)菌檢(jian)驗(yan)。主(zhu)要(yao)采(cai)用(yong)過濾(lv)除菌：如(ru)胰(yi)酶(mei)、抗生(sheng)素、G-418 溶(rong)液、各(ge)類培養(yang)基(ji)、丙(bing)酮酸(suan)鈉、谷氨酰(xian)胺等。有些可(ke)以采(cai)用(yong)高壓(ya)滅菌：如(ru) PBS、D-Hank's等(deng)。
 

　　試(shi)劑分(fen)裝(zhuang)保存(cun)
 

　　包括(kuo)營(ying)養液(ye)、胰(yi)酶(mei)、血(xue)清(qing)等(deng)。
 

　　血(xue)清(qing)特(te)別(bie)重要(yao)。血(xue)清(qing)必須(xu)貯存(cun)於 –20℃低(di)溫培(pei)養箱，如果(guo)壹(yi)次(ci)無(wu)法(fa)用(yong)完壹(yi)瓶，可(ke)將(jiang) 40～50ml 分(fen)裝(zhuang)於無(wu)菌酸(suan)處理(li)瓶中，甚至置青(qing)黴(mei)素瓶保(bao)存。壹(yi)般(ban)廠商提(ti)供(gong)的血(xue)清(qing)為(wei)無菌，不(bu)需(xu)再無(wu)菌過(guo)濾(lv)。若發現(xian)血(xue)清(qing)有(you)許(xu)多懸(xuan)浮(fu)物，則可(ke)將(jiang)血(xue)清(qing)加(jia)入(ru)培(pei)養基內壹(yi)起(qi)過濾(lv)，勿(wu)直(zhi)接過(guo)濾(lv)血(xue)清(qing)。(壹(yi)般(ban)情況(kuang)下不(bu)影(ying)響細胞(bao)培(pei)養)
 

　　瓶裝(zhuang)血(xue)清(qing)壹(yi)定要(yao)逐(zhu)步解凍(dong): 4℃ 冰(bing)箱(xiang)全(quan)溶(rong)後再分(fen)裝(zhuang)，在(zai)溶(rong)解過(guo)程(cheng)中須(xu)規則搖(yao)晃均(jun)勻(小心勿造成(cheng)氣泡(pao))，使溫(wen)度(du)與成(cheng)分(fen)均(jun)壹(yi)，減少(shao)沈澱(dian)的發生(sheng)。勿(wu)直接由 –20℃ 直(zhi)接(jie)至 37℃ 解(jie)凍(dong)，因溫(wen)度(du)改變太(tai)大(da)，容易造成(cheng)蛋白(bai)質凝(ning)結(jie)而發生(sheng)沈澱(dian)。
 

　　熱滅活(huo)是(shi)指 56℃，30 分鐘(zhong)加熱已(yi)*解凍(dong)之(zhi)血(xue)清(qing)。水(shui)浴(yu)鍋升到(dao) 56℃後，將(jiang)血(xue)清(qing)放入(ru)，待(dai)溫度(du)升高到(dao) 56℃ 後計時，壹(yi)般(ban) 5 分鐘(zhong)左右(you)規則搖(yao)晃均(jun)勻壹(yi)次(ci)。此(ci)熱處(chu)理之(zhi)目(mu)的是使血(xue)清(qing)中之(zhi)補(bu)體(ti)成(cheng)份(fen)去(qu)活(huo)化。除非(fei)必須(xu)，壹(yi)般(ban)不要(yao)作(zuo)此(ci)熱處(chu)理，因(yin)為(wei)會造成(cheng)沈澱(dian)物之(zhi)顯著(zhu)增(zeng)多，且(qie)會影響血(xue)清(qing)之(zhi)品質。註(zhu)意(yi)更換新(xin)血(xue)清(qing)(包括(kuo)不同批次(ci))對(dui)細胞(bao)的影響(xiang)。
 

　　無菌意(yi)識要(yao)強(qiang)
 

　　實(shi)驗(yan)進(jin)行(xing)前(qian)，超(chao)凈(jing)臺以紫(zi)外燈照(zhao)射 30 分鐘(zhong)滅菌，以 70 % ethanol 擦(ca)拭無菌操作(zuo)擡(tai)面(mian)，並(bing)開(kai)啟(qi)超凈(jing)工(gong)作(zuo)臺風(feng)扇運(yun)轉數分鐘(zhong)後，才開(kai)始(shi)實(shi)驗(yan)操作(zuo)。
 

　　每(mei)次(ci)操作(zuo)只(zhi)處(chu)理壹(yi)株細胞(bao)株，以避(bi)免失(shi)誤混(hun)淆或細胞(bao)間(jian)汙染(ran)。實(shi)驗(yan)完畢後(hou)，將(jiang)實(shi)驗(yan)物品(pin)帶出(chu)工(gong)作(zuo)臺，以 70 % ethanol 擦(ca)拭無菌操作(zuo)擡(tai)面(mian)。
 

　　無(wu)菌操作(zuo)工(gong)作(zuo)區域(yu)應(ying)保(bao)持(chi)清(qing)潔(jie)及(ji)寬敞(chang)，必要(yao)物品(pin)，例(li)如(ru)支(zhi)架、吸(xi)管等(deng)公用(yong)物品(pin)可以暫(zan)時(shi)放置，其它(ta)個人(ren)實(shi)驗(yan)用(yong)品用(yong)完應(ying)立(li)即(ji)拿出(chu)。實(shi)驗(yan)用(yong)品以 70% 乙(yi)醇擦拭後(hou)才帶入(ru)無(wu)菌操作(zuo)臺內(nei)。實(shi)驗(yan)操作(zuo)應(ying)在(zai)中央無(wu)菌區域(yu)，壹(yi)般(ban)勿在(zai)邊緣(yuan)區域(yu)操作(zuo)。
 

　　小心取用(yong)無菌之(zhi)實(shi)驗(yan)物品(pin)，避免造成(cheng)汙(wu)染(ran)。勿碰觸吸(xi)管尖頭部或是(shi)容(rong)器(qi)瓶口(kou)，亦不要(yao)在(zai)打開(kai)之(zhi)容器(qi)正上方(fang)操作(zuo)實(shi)驗(yan)。容器(qi)打開(kai)後(hou)，以手(shou)夾(jia)住(zhu)瓶蓋並握住(zhu)瓶身(shen)，傾斜約(yue) 45° 角(jiao)取用(yong)，盡(jin)量(liang)勿將(jiang)瓶蓋蓋口朝上放置桌(zhuo)面。
 

　　選(xuan)擇正(zheng)確(que)的培養(yang)基
 

　　不(bu)同的細胞(bao)可(ke)能培(pei)養(yang)基不同(tong)，甚至不(bu)同(tong)的文(wen)獻(xian)可能(neng)對(dui)相(xiang)同(tong)的細胞(bao)培(pei)養基(ji)成(cheng)分(fen)也是可(ke)能不(bu)同(tong)的。當時培(pei)養(yang)神經(jing)幹細胞(bao)，有(you)文(wen)獻(xian)就(jiu)選用(yong) neurobase 培養(yang)基(ji)，實(shi)驗(yan)目(mu)的主要(yao)是(shi)做(zuo)抗氧(yang)化和氧(yang)化方(fang)面(mian)的，而這(zhe)種培養(yang)基中含有(you)抗(kang)氧化劑成(cheng)分(fen)，此(ci)時，不得(de)不選(xuan)擇另(ling)外(wai)壹(yi)種不含抗(kang)氧(yang)化劑的培養(yang)基。
 

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