恒溫培養(yang)箱(xiang)應用(yong)於(yu)大(da)腸(chang)桿菌細胞(bao)的(de)制備實驗

    電(dian)熱恒(heng)溫培(pei)養(yang)箱采(cai)用(yong)電(dian)熱膜(mo)加熱方(fang)式(shi)，在(zai)箱體與(yu)內膽之(zhi)間安裝(zhuang)電(dian)熱膜(mo)，使用(yong)熱傳(chuan)遞方(fang)式(shi)加熱，加熱速(su)度快(kuai)。多(duo)應用(yong)於(yu)實驗室的各(ge)種細胞(bao)菌類的培(pei)養，今天(tian)要(yao)說(shuo)的(de)是大(da)腸(chang)桿菌，下面(mian)喆圖(tu)小編(bian)講(jiang)壹(yi)些(xie)操(cao)作(zuo)流(liu)程(cheng)供(gong)大(da)家參(can)考(kao)壹(yi)下。

    細胞(bao)經過壹(yi)些(xie)特(te)殊(shu)方(fang)法(fa)（電(dian)擊(ji)法、CaCl2法(fa)）等處理(li)後(hou)，細胞(bao)膜(mo)的通透性(xing)發(fa)生(sheng)了暫時(shi)性(xing)的(de)改變(bian)，成為能允(yun)許(xu)外(wai)源DNA分(fen)子進入(ru)的(de)細胞(bao)，即(ji)感(gan)受(shou)態(tai)細胞(bao)（Compenent cells）。

實驗方(fang)法(fa)原理：

   帶有(you)外(wai)源DNA 的重組質粒，在(zai)體外(wai)構建(jian)後(hou)，導入(ru)宿(xiu)主細胞(bao)，隨(sui)著細胞(bao)的(de)大(da)量復制(zhi)、繁(fan)殖(zhi)，才能夠有(you)機(ji)會獲(huo)得(de)純(chun)的重組質粒DNA，該過程(cheng)稱(cheng)之(zhi)為轉化過(guo)程(cheng)。受(shou)體細胞(bao)經過壹(yi)些(xie)特(te)殊(shu)方(fang)法(fa)（如：CaCl2，RuCl 等化學(xue)試劑(ji)）的(de)處理(li)後(hou)，細胞(bao)膜(mo)的通透性(xing)發(fa)生(sheng)變(bian)化，能容許(xu)外(wai)源DNA 的載體分(fen)子通過。

實驗材(cai)料(liao)：

E. coli DH5α菌株(zhu)

 試劑(ji)、試劑(ji)盒：LB固(gu)體培(pei)養(yang)基(ji)、LB液體培(pei)養(yang)基(ji)、CaCl2、硫酸鎂(mei)、SOB、TFB

    儀器(qi)、耗(hao)材(cai)：培(pei)養(yang)皿、恒(heng)溫搖(yao)床、聚丙烯管、電(dian)熱恒(heng)溫培(pei)養(yang)箱、臺(tai)式高速離心機、無(wu)菌工(gong)作(zuo)臺、燒(shao)瓶(ping)、恒(heng)溫(wen)水浴鍋(guo)、低溫(wen)冰箱、制(zhi)冰機、分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、微(wei)量移(yi)液(ye)槍(qiang)、錐(zhui)形瓶(ping)、試管

實驗步(bu)驟(zhou)：

1、從(cong)37℃培養16-20 h的平(ping)板(ban)中(zhong)挑取(qu)壹(yi)個單菌落(luo)(直徑(jing)2-3 mm)，轉到壹(yi)個含有(you)100 ml LB或(huo)SOB培養基(ji)的1L燒瓶(ping)中(zhong)。於(yu)37℃劇(ju)烈振搖培養3 h。壹(yi)般(ban)經驗，1 OD600約含有(you)大(da)腸(chang)桿菌DH5α 109 個/mL。

2、將(jiang)細菌轉移(yi)到(dao)壹(yi)個無(wu)菌、壹(yi)次(ci)性(xing)使(shi)用(yong)的(de)、用(yong)冰預冷的(de)50 ml聚丙烯管中，在(zai)冰上放(fang)置10 min，培(pei)養物冷卻至0℃。

3、於(yu)4℃用(yong)Sorvall GS3特(te)頭(tou)（或與(yu)之(zhi)相當的(de)轉頭(tou)）以(yi)4 100 r/min離心10 min，以(yi)回收(shou)細胞(bao)。

4、倒(dao)出培(pei)養液(ye)，將(jiang)管倒置1 min以(yi)使後(hou)的痕量培養液流(liu)盡(jin)。

5、每(mei)50 ml初(chu)始培養(yang)液(ye)用(yong)30 ml預冷的(de)0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶(rong)液(ye)(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重懸(xuan)每(mei)份細胞(bao)沈(chen)澱(dian)。

6、於(yu)4℃用(yong)Sorvall GS3轉頭(tou)（或與(yu)之(zhi)相當的(de)轉頭(tou)）以(yi)41 00 r/min離心10 min，以(yi)回收(shou)細胞(bao)。

7、倒(dao)出培(pei)養液(ye)，將(jiang)管倒置1min以(yi)使後(hou)的痕量培養液流(liu)盡(jin)。

8、每(mei)50ml初(chu)始培養(yang)物用(yong)2ml用(yong)冰預冷的(de)0.1mol/L CaCl2(或(huo)TFB)重懸(xuan)每(mei)份細胞(bao)沈(chen)澱(dian)。

9、此(ci)時(shi)，可以(yi)用(yong)新(xin)鮮(xian)制備的(de)感(gan)受(shou)態(tai)細胞(bao)直接(jie)做(zuo)轉化實驗，也可以(yi)將(jiang)細胞(bao)凍存於(yu)-70℃。

註意(yi)事(shi)項(xiang)：

1.為(wei)達(da)到轉化，活(huo)細胞(bao)數務(wu)必(bi)少於(yu)108個細胞(bao)/mL，對(dui)於(yu)大(da)多(duo)散大(da)腸(chang)桿菌來(lai)說(shuo)，這(zhe)相(xiang)當於(yu)OD值(zhi)為(wei)0.4左(zuo)右。為(wei)保證細菌培(pei)養(yang)物的(de)生(sheng)長(chang)密度(du)不(bu)致(zhi)過高，可每(mei)隔(ge)15-20min測定(ding)OD600值來(lai)監測，用(yong)監測的(de)時(shi)間及OD值列(lie)壹(yi)個圖(tu)表，以(yi)便預測培(pei)養(yang)物的(de)OD600值(zhi)到0.4的(de)時(shi) 間，當OD600值(zhi)達到(dao)0.35時(shi)，收獲(huo)細菌培(pei)養(yang)物。

 2.在(zai)菌株(zhu)與(yu)菌株(zhu)之(zhi)間，OD值與(yu)每(mei)毫升中活(huo)細胞(bao)散間的關(guan)系(xi)變(bian)化很(hen)大(da)，因此(ci)有(you)必(bi)要通過漶量特定(ding)腦(nao)桿菌的(de)生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)物在(zai)生(sheng)長(chang)周(zhou)期的(de)不(bu)同(tong)時(shi)相的(de)OD600值，並將(jiang)各(ge)稀(xi)釋維度的(de)培(pei)養物鋪(pu)於(yu)無(wu)抗生(sheng)素的(de)LB瓊脂(zhi)板以(yi)計(ji)算(suan)每(mei)壹(yi)時(shi)相的(de)活細胞(bao)散，從(cong)而使(shi)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)讀(du)數得(de)到標準化。

3.對(dui)大(da)多(duo)數大(da)腸(chang)桿菌（MC106除(chu)外(wai)），采(cai)用(yong)TFB代(dai)替(ti)CaCl2可得(de)到相同(tong)或(huo)更(geng)好的結(jie)果(guo)。Dagert和(he)Ehrlieh的實驗(1979)曾表明(ming)，細胞(bao)可以(yi)於(yu)4℃在(zai)CaCl2溶(rong)液(ye)中(zhong)保存24-48 h，在(zai)貯(zhu)存(cun)的(de)初(chu)12-24 h內，轉化率(lv)增加4-6倍，然(ran)後(hou)降低到(dao)初(chu)始水平(ping)。

4.克(ke)隆的新(xin)鮮(xian)程(cheng)度(du)，壹(yi)定(ding)要選新鮮(xian)平(ping)板(ban)的(de)單(dan)克隆，即(ji)剛(gang)塗(tu)布(bu)生(sheng)長(chang)過(guo)夜(ye)的平(ping)板(ban)。

5.菌體的(de)OD600值(zhi)，JM109或BL21，OD值(zhi)為0.35，DH5α為0.4，要盡(jin)量保證OD值不(bu)要(yao)過高，更不(bu)能超過(guo)0.6。

6.低溫(wen)處理(li)的(de)時(shi)間，做完(wan)後(hou)冰上保(bao)存(cun)12-24h後(hou)分(fen)裝(zhuang)，並保(bao)存(cun)於(yu)-80℃。

7.試劑(ji)和(he)用(yong)品，所有(you)的(de)用(yong)品（離心管、藥(yao)瓶(ping)等）用(yong)新(xin)的(de)，如果(guo)使(shi)用(yong)舊(jiu)的(de)，要確(que)保幹(gan)凈(jing)，CaCl2溶(rong)液(ye)。